一、實驗室網(wǎng)絡設置

　　實驗室網(wǎng)絡由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所國家流感中心和省級流感實驗室兩級組成。

　　二、實驗室條件及生物安全操作的要求

　　1.省級流感實驗室實驗條件及生物安全的操作要求

　　(1)實驗生物安全要求：安全Ⅱ級+(BSL-2級+)或安全Ⅲ級(BSL-3級)。

　　(2)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測、血清學檢測中用到的血凝抑制實驗(HI)可以在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實驗室里操作。

　　(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實驗室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進行病毒核酸檢測的實驗室要求請參照國家有關核酸檢測要求的規(guī)定。

　　(4)微量中和實驗、特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽性的采樣標本的病毒分離、尸檢標本的檢測必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。

　　(5)省級流感實驗室實驗條件：具備進行禽流感相關臨床標本初篩所需的生物安全柜、離心機、PCR儀、電泳儀、紫外線檢測儀等配套設備。

　　2.國家流感中心

　　實驗生物安全要求：生物安全Ⅱ級+(BSL-2級+)和生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室。

　　3.省級流感實驗室職責

　　(1)禽流感采樣標本的臨床標本特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測；

　　(2)禽流感H5的血清學檢測工作;

　　(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽性標本的病毒分離必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室；

　　(4)沒有生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室的，將標本送國家流感中心做病毒的分離工作。

　　4.國家流感中心實驗室職責

　　(1)國家流感中心設立在中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感室；

　　(2)對各省報告的禽流感疑似病例或確診病例進行復核、確認；

　　(3)對不具備禽流感病毒分離條件的省份送檢標本的檢測、分離和確認；

　　(4)對需要做微量中和實驗的血清標本進行微量中和試驗；

　　(5)對各省級實驗室檢測人員的培訓；

　　(6)對各省級流感實驗室的質量控制。

　　三、原始標本采集

　　1.標本采集人員

　　醫(yī)療機構的醫(yī)生、護士或當?shù)丶膊☆A防控制中心專業(yè)人員負責標本采集并填寫標本登記表，標本采集人員按照《禽流感職業(yè)暴露人員防護原則》做好個人防護。

　　2.標本采集種類和時限

　　(1)采集標本的種類：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。

　　(2)采集標本時間：

　　1)咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；

　　2)急性期血清在發(fā)病后7天內采集，恢復期血清在發(fā)病后2-4周采集；

　　3)尸檢標本尸檢時采集。

　　3.標本的運送：所有采集的標本應在醫(yī)院采集時立即分裝，一式二份，其中一份單獨保存，以備復核。采集的標本若不能在24小時內送達，則應盡快在-70℃以下保存。無-70℃條件的需在-20℃冰箱短時間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標本。

　　4.標本采集的方法：詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》

　　四、送流感中心的標本包裝、運送與接收

　　1.標本的包裝

　　(1)標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內有橡膠圈的塑料管里，擰緊。

　　(2)將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋內密封；每袋裝一份標本。

　　(3)直接在塑料管上用油性記號筆寫明樣本的種類、采樣時間、編號、姓名，同時也將標本有關信息填在禽流感人體標本送檢登記表，連同塑料管用另一塑料袋內密封。

　　(4)將裝標本的密封袋放入專用運輸箱內(或疫苗冷藏包)，放入冰排，然后以柔軟物質填充，內襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一個塑料袋內再次做密封。若將進行病毒分離，可將密封好的裝有標本的容器直接放入液氮運輸罐內運輸。所有容器必須印有生物危險標識。

　　2.標本運送

　　(1)航空或鐵路運送。

　　(2)專人專車運送：主要用于近距離樣品運送。

　　3.標本的接收

　　(1)各省級中心實驗室應公布標本接收聯(lián)系方式，并實行24小時標本接收制；

　　(2)國家實驗室標本接收：

　　需送國家流感中心實驗室檢測的原始標本、病毒分離物、可疑陽性標本、血清等，填寫標本送檢登記表，在低溫保存條件下，于24小時內送至中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所流感中心進行復核。國家流感中心標本接收聯(lián)系方式為：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，地址：北京市宣武區(qū)迎新街100號，聯(lián)系人：郭元吉、王敏，聯(lián)系電話：010-63534632，010-63581337，傳真：(010)63534632。

　　五、標本檢測方法

　　1.禽H5病毒核酸檢測：

　　材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。

　　方法：RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒的快速檢測、測序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取試劑盒、逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶等試劑,建議使用德國QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR產(chǎn)物純化)產(chǎn)品。2.病毒分離及鑒定：

　　材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。

　　方法：采用雞胚和MDCK細胞分離方法，血凝及血凝抑制試驗(HAI)具體方法詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。經(jīng)特異性H5 RT-PCR病毒核酸檢測陽性的采樣標本的病毒分離及鑒定工作必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。

　　試劑：雞胚接種采用SPF雞胚，MDCK細胞等。

　　3.疑似病例的血清學檢測：

　　材料：疑似病例的急性期和恢復期的雙份血清

　　方法：血凝抑制實驗具體方法詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。

　　試劑：H5滅活病毒。

　　4.微量中和試驗

　　材料：疑似病例的急性期和恢復期的雙份血清

　　試劑：H5活病毒，必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。

　　六、檢測結果的確認

　　以下情況的原始標本及分離物送國家流感中心檢測、復核、確認。

　　1.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5血凝抑制試驗(HI)陰性，H5的RT-PCR檢測陽性。

　　2.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5血凝抑制試驗(HI)陽性或H5的RT-PCR檢測陽性。

　　3.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5的RT-PCR檢測陽性。

　　4.病人恢復期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。

　　5.標本分離陽性，H5血凝抑制試驗陰性，并已排除了是當前流行的甲、乙型毒株的可能。

　　七、檢測結果報告

　　一般情況下,實驗室收到的樣本立即進行實驗，并于收到標本后24小時內出具RT-PCR檢測報告，3-5天出具病毒分離培養(yǎng)結果，于分離到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制結果，微量中和實驗須3-5天完成。當實驗過程中出現(xiàn)不可預測情況或意外事件，影響了按時出具報告時，應及時報告和說明。